Hai năm sau trận chiến ở New York[lower-alpha 1], Steve Rogers hiện đang làm việc cho cơ quan gián điệp S.H.I.E.L.D. dưới sự chỉ huy của Nick Fury. Trong một nhiệm vụ, Rogers cùng đặc vụ Natasha Romanoff được gửi đi để giải cứu nhóm con tin gồm những nhân viên kỹ thuật của S.H.I.E.L.D. trên tàu Ngôi sao Lemurian, trong đó có một sĩ quan tên Jasper Sitwell, và được hỗ trợ bởi một đội S.T.R.I.K.E do Brock Rumlow đứng đầu. Sau khi đánh bại tên cầm đầu là George Bartroc, Rogers phát hiện Romanoff đang sao lưu dữ liệu từ máy tính của S.H.I.E.L.D ra một ổ USB flash, hai người tranh cãi về việc làm của cô. Cùng lúc đó Batroc tỉnh lại, ném lựu đạn vào họ nhưng Rogers đã kịp lúc hất lựu đạn ra và cứu cả hai.

Trở về Triskelion, trụ sở chính của S.H.I.E.L.D, Rogers truy hỏi Fury về động cơ đằng sau việc làm của Romanoff. Fury nói rằng mình đã phái người lính vĩ đại nhất lịch sử để ngăn rắc rối xảy ra, ông còn cho biết mình đã mất một con mắt khi tin "ai đó". Để củng cố cho lập luận của mình, Fury giới thiệu cho Rogers về dự án Insight dựa trên đề xuất của ông sau trận New York, là một dự án phóng 3 chiếc Helicarrier thế hệ mới có vũ trang lên quỹ đạo, đồng bộ với hệ thống vệ tinh định vị phóng từ tàu Ngôi sao Lemurian nhằm tìm kiếm và tiêu diệt phủ đầu các mối gây hại. Rogers cho rằng đây không phải tự do, mà là nỗi sợ. Không thể giải mã dữ liệu do Romanoff lấy được, Fury nghi ngờ dự án Insight, ông nhờ bộ trưởng Alexander Pierce trì hoãn dự án.

Rogers tham quan Bảo tàng Smithsonian hiện đang có một cuộc triển lãm dành riêng cho Captain America. Sau đó, anh đến thăm Peggy Carter, cô lúc này đã già. Cô bị bệnh và vẫn nhận ra Rogers, cô sốc khi nhìn thấy mối tình đầu còn sống. Anh chỉ nói: "Anh không thể rời khỏi cô gái tuyệt nhất của anh, nhất là khi cô gái ấy còn nợ anh một điệu nhảy." Sau khi rời bệnh viện, Rogers đến gặp Sam Wilson (Falcon), một người bạn mới của anh, vốn là lính không quân đã giải ngũ sau khi trợ thủ tử trận.

Fury đang lái xe trên đường đến điểm hẹn với đặc vụ Maria Hill thì bị phục kích bởi những kẻ giả danh cảnh sát và một sát thủ bí ẩn đã hoạt động 50 năm nay được gọi là Chiến binh Mùa đông. Tuy bị thương nhưng ông vẫn trốn thoát được đến căn hộ của Rogers. Trở về nhà, Rogers gặp Fury và được ông cảnh báo rằng S.H.I.E.L.D. đang có vấn đề. Ngay sau đó, ông bị bắn hạ bởi Chiến binh Mùa đông, nhưng đã kịp đưa cho anh ổ đĩa cùng lời dặn đừng tin ai trước khi bất tỉnh. Cô hàng xóm tiết lộ mình là Đặc vụ 13 do Fury cử đến để bảo vệ anh. Rogers đuổi theo Chiến binh Mùa đông nhưng hắn đã chạy thoát. Sau khi Fury được cho là đã chết trong cuộc phẫu thuật và được Hill đưa đi, Pierce triệu tập Rogers đến Triskelion. Pierce cho anh biết S.H.I.E.L.D đã điều tra ra chính Fury đã thuê Batroc (mới bị bắt tối qua) làm bình phong để đánh cắp dữ liệu trên tàu và truy hỏi anh về lý do ông đến nhà anh trước khi bị giết. Tuy ngạc nhiên nhưng anh vẫn giữ bí mật về việc Fury cho rằng S.H.I.E.L.D. đang thoái hóa và ổ đĩa mà Fury đã giao cho mình.

Một đội S.T.R.I.K.E do Rumlow cầm đầu định bắt giữ Rogers trong thang máy, nhưng bị anh phát hiện trước và bị đánh bại toàn bộ. Anh sau đó trốn khỏi Triskelion, tiêu diệt cả một chiếc Quinjet cản đường. Thấy vậy, Pierce phát lệnh truy nã Rogers vì che giấu thông tin đằng sau cái chết của Fury. Và với việc Fury bị coi là kẻ phản bội, Hội đồng An ninh Thế giới cho triển khai ngay Dự án Insight. Rogers gặp Romanoff, cả hai cùng giải mã ổ đĩa. Họ phát hiện ra một cơ sở bí mật của S.H.I.E.L.D. ở trại Lehigh, New Jersey, nơi anh từng được huấn luyện, nay dường như đã bị bỏ hoang. Nhưng tại đây, họ tình cờ tìm thấy và kích hoạt một siêu máy tính mà trí tuệ nhân tạo chính là Arnim Zola, vốn được chẩn đoán mắc bệnh nan y vào năm 1972 nhưng đã tải ý thức của mình vào đây. Zola cho biết khi được thành lập sau Thế chiến II, S.H.I.E.L.D. đã tuyển mộ ông ta về phục vụ. Tận dụng cơ hội này, Zola và đồng bọn đã hồi sinh HYDRA bên trong S.H.I.E.L.D, bí mật gây ra các cuộc xung đột, trong đó có sai Chiến binh Mùa đông ám sát hai nhân vật cấp cao là Howard Stark và Nick Fury. Ông ta còn tiết lộ dữ liệu trong ổ đĩa là một thuật toán do mình viết cho dự án Insight nhằm tạo nên một thế giới mà nhân loại phải "tự nguyện" từ bỏ tự do theo niềm tin của chúng. Ngay sau đó một tên lửa của S.H.I.E.L.D. phá hủy trại nhưng Rogers và Romanoff đã kịp thoát khỏi.

Hai người đến nhà của Wilson nhờ giúp đỡ. Sau khi suy luận Pierce là thủ lĩnh hiện tại của HYDRA, họ bắt cóc Sitwell, cũng là một thành viên của chúng. Hắn khai rằng thuật toán Zola là một chương trình phân tích dữ liệu cá nhân để xác định những người hiện tại hoặc trong tương lai là mối đe dọa đối với HYDRA, rồi hàng triệu mục tiêu sẽ bị những chiếc Helicarrier của dự án thủ tiêu trong chốc lát. Sau đó Chiến binh Mùa đông phục kích họ và giết chết Sitwell. Rogers nhận ra Chiến binh Mùa đông là Bucky Barnes, người bạn thân tưởng như đã chết của anh. Hóa ra cú rơi năm xưa chỉ khiến Barnes mất cánh tay trái, nhưng anh bị Hồng Quân tìm thấy và bị tẩy não thành sát thủ của HYDRA, dành thời gian giữa các phi vụ trong buồng ngủ đông. Sau đó bộ ba bị bắt nhưng Maria Hill đã giải cứu họ, họ theo Hill và gặp lại Fury còn sống nhờ dùng độc tố giảm nhịp tim.

Hội đồng An ninh Thế giới đến buổi ra mắt dự án Insight. Nhưng trước khi dự án bắt đầu, Rogers thông báo vào loa phát thanh, cho mọi người trong tòa nhà biết S.H.I.E.L.D đã bị HYDRA kiểm soát và âm mưu của chúng đằng sau dự án Insight. Romanoff cải trang thành một trong những thành viên Hội đồng và tước vũ khí Pierce. Fury đến hỗ trợ cô khống chế Pierce mở khóa cơ sở dữ liệu của S.H.I.E.L.D., mặc dù cô cũng sẽ bị lộ quá khứ của mình. Trong lúc đó, Rogers và Wilson đột nhập vào hai chiếc Helicarrier và thay thế chip điều khiển của chúng. Nhưng khi tới chiếc thứ ba thì Chiến binh Mùa đông phục kích họ, phá hủy bộ đồ của Wilson và chiến đấu với Rogers. Rogers hạ gục Chiến binh Mùa đông và thay thế chip cuối cùng, cho phép Hill điều khiền các Helicarrier tiêu diệt lẫn nhau. Sau khi chứng kiến cơ sở dữ liệu của S.H.I.E.L.D. được tải lên và thất bại của dự án Insight, Pierce kích nổ bom trong thẻ an ninh mà hắn lừa Hội đồng đeo để giết họ và uy hiếp Romanoff hòng chạy trốn, nhưng Romanoff làm nhiễu thẻ của mình bằng đĩa điện, khiến Pierce sơ hở và bị Fury bắn chết. Chiến binh Mùa đông tấn công Rogers nhưng Rogers không chống trả và giúp bạn mình bước đầu nhớ mình là ai. Nỗ lực của anh thành công khi Rogers rơi xuống Sông Potomac và bất tỉnh, nhưng Chiến binh Mùa đông cứu Rogers vào bờ rồi bỏ trốn.

Sau khi bình phục, Fury gặp Rogers và Wilson tại ngôi mộ giả của ông. Trước khi đi tìm tàn dư của HYDRA, ông nói với họ rằng nếu có ai hỏi về ông, họ chỉ cần đến đây. Romanoff tới sau đó, cô đưa cho Rogers một hồ sơ về Barnes, sau đó cô giới thiệu với anh về Đặc vụ 13, có tên thực là Sharon (Sharon Carter). Rogers nhìn tập tin về các thông tin liên quan đến Barnes. Wilson biết rằng Rogers sẽ tìm Barnes. Rogers nói với Wison rằng Wilson không phải đi với anh. Nhưng Wilson trả lời: "Tôi biết. Khi nào chúng ta bắt đầu?"

Trong một đoạn mid-credits, Wolfgang von Strucker, tại một phòng thí nghiệm của HYDRA, tuyên bố rằng "thời kì của phép lạ" đã bắt đầu với việc các nhà khoa học tiến hành kiểm tra Cây Trượng và một cặp sinh đôi là hai người thí nghiệm sống sót: nam sở hữu tốc độ siêu phàm, nữ có quyền năng điều khiển các vật thể. Trong đoạn post-credits, Barnes thăm một khu tưởng niệm chính mình tại Viện Smithsonian, và bắt đầu nhớ lại được thân phận thật sự của anh.